Descrizione di prodotto

Corredo veloce V2 della preparazione della biblioteca del DNA

[Nome di prodotto]

Corredo veloce V2 della preparazione della biblioteca del DNA

[Gatto. No/spec.]

Rxns K001S-A/24; Rxns K001S-B/96; rxns del sacco 6 del campione

[Descrizione di prodotto]

Puntando sulla alto-capacità di lavorazione di Illumina che ordina la piattaforma, questo corredo fornisce uno schema di costruzione conveniente ed universale della biblioteca del DNA in un tubo. Combina la riparazione e la Un-parte incastrata di un mattone in aggetto dell'estremità in un punto, notevolmente accorciante il periodo della costruzione delle biblioteche e riducente l'errore causato dai punti noiosi. La preparazione dell'estremità, la legatura dell'adattatore, l'amplificazione e la purificazione del DNA a doppia elica spezzettato possono essere eseguite in circa 2 ore. La quantificazione completa delle biblioteche può essere eseguita dal metodo della tintura fluorescente del dsDNA (per esempio, termo Qubit Flex Fluorometer) o dalla PCR assoluta di quantificazione dopo la diluzione della biblioteca ad una concentrazione appropriata.

[Tipo del campione]

[Condizione di stoccaggio & durata di prodotto in magazzino]

Tutti i reagenti dovrebbero essere immagazzinati all'amplificatore di legatura di -20°C. è normali affinchè i cristalli precipitino alle basse temperature, dovrebbero essere equilibrati alla temperatura ambiente prima dell'uso. Il prodotto è valido per 12 mesi.

[Componenti]

* se c'è più di un campione, la miscela dell'iniettore dell'adattatore #K002 e #K003 è raccomandata. Questo corredo fornisce ad un insieme degli iniettori l'indice.

Nota: perle raccomandate di selezione: Perle di selezione Magbeads o di AMPure XP del DNA di #NC1011 GDSPure.

[Note]

1. Offriamo due tipi di iniettori universali dell'adattatore messi (adattatore di GDS, #K002 e #K003, acquistati esclusivamente), ma i clienti possono anche scegliere da altri produttori o sintetizzare il loro proprio adattatore per il Illumina che ordina la piattaforma. Troppo adattatore condurrà alla formazione di dimero dell'adattatore e l'adattatore insufficiente condurrà all'uscita bassa delle biblioteche. Di conseguenza, la concentrazione appropriata nell'adattatore determina la concentrazione e la qualità di biblioteca. Le concentrazioni raccomandate nell'adattatore per gli importi differenti dell'input del DNA sono indicate nella seguente tavola:

Concentrazioni raccomandate in uso della tabella 1 dell'adattatore

* adattatore: Il rapporto grammomolecolare dell'inserzione si riferisce al rapporto del numero molare dell'adattatore da altre fonti al numero molare introdotto del DNA, che può essere calcolato approssimativamente riferendosi alla seguente formula:

Introdotto DNA numero (pmol) ≈Input DNA massa)/[(di NG lunghezza di media del DNA 0.66×Input (punto di ebollizione)]

qualità del *The e concentrazione dell'adattatore notevolmente colpire l'uscita della biblioteca, particolarmente per le biblioteche basse dell'input. L'adattatore da una fonte di alta qualità dovrebbe essere selezionato e diluito ad una concentrazione appropriata con 0.1×TE prima della legatura. Per uso immediato, assicuri che ogni aggiunta del campione sia i 5 fissi μl, eviti gli errori dell'aggiunta del campione e provi ad evitare il gelata-disgelo ripetuto.

2. L'enzima utilizzato nella miscela matrice di PCR delle biblioteche AD ALTA FEDELTÀ 2× è una DNA polimerasi della famiglia di B, che ha 5" - 3" polimerasi e 3" - 5" attività di exonuclease, ma manca di 5" - 3" attività di exonuclease. Ha l'alta fedeltà ed omogeneità e forte abilità sostenibile della sintesi. Il controllo rigoroso del numero dei cicli di amplificazione è particolarmente importante per l'uscita delle biblioteche. La seguente tavola mostra il numero raccomandato dei cicli di amplificazione che corrispondono agli importi differenti dell'input del DNA:

Numero raccomandato della tabella 2 dei cicli di amplificazione che corrispondono agli input differenti del campione

Nota: 1. La tavola di cui sopra mostra i risultati dei test usando 150bp DNA standard, che è per riferimento soltanto.

2. Se i connettori incompleti sono utilizzati, un numero minimo dei cicli (1-3) dovrebbe essere amplificato per ottenere una biblioteca completa.

3. Se la qualità del DNA dell'input è povera, o la selezione di dimensione è effettuata durante la costruzione delle biblioteche, il numero dei cicli di amplificazione dovrebbe essere aumentato giustamente.

[Processo standard della costruzione delle biblioteche]

Riparazione di conclusione

Nota: Se il DNA spezzettato supera il μl 45 prima che questo punto, o l'amplificatore sia incompatibili con l'amplificatore della riparazione di conclusione, una purificazione magnetica della perla dovrebbe essere eseguita in primo luogo.

1. Prepari la seguente reazione in un tubo di PCR di 200 μl:

2. Vortice delicatamente e rotazione giù brevemente per mescolarsi bene, centrifugare brevemente e raccogliere tutto il liquido al fondo del tubo.

3. Esegua la seguente reazione in un cycler termico:

Legatura dell'adattatore

1. Procedi appena possibile alla reazione di legatura dopo la preparazione dell'estremità.

2. Diluisca l'adattatore secondo la tabella 1.

3. Prepari il seguente sistema di reazione:

4. Vortice delicatamente e rotazione giù brevemente per mescolarsi bene, centrifugare brevemente e raccogliere tutto il liquido al fondo del tubo.

5. Esegua la seguente reazione in un cycler termico:

Soluzione raccomandata per pulizia di PCR/selezione di dimensione (il volume magnetico specifico della perla dovrebbe essere il regolato secondo la dimensione del campione reale)

1. Prepari 100 prodotti di legatura del μl in un tubo centrifugo appropriato.

2. Aggiunga il μl 100 delle perle magnetiche risospese di selezione del DNA al campione. Delicatamente colpo con una pipetta per 10 volte (o vortice per 30 s). Incubi i campioni per il min 5 alla temperatura ambiente.

3. Disponga il tubo su uno scaffale magnetico appropriato per separare le perle dal surnatante. Quando la soluzione è chiara, rimuovere e scartare con attenzione il surnatante con una pipetta (non scarti le perle).

4. Aggiunga un μl 200 dell'etanolo appena preparato di 80% al tubo mentre nello scaffale magnetico. Incubi alla temperatura ambiente per 30 s e poi rimuovere e scartare con attenzione il surnatante (non disturbi le perle).

5. Ripeti una volta punto 4 per complessivamente due lavaggi.

Nota: Sia sicuro di rimuovere tutto il liquido visibile dopo seconda Washington.

6. Asciughi all'aria le perle finché la superficie delle perle magnetiche non abbia lucentezza ovvia mentre il tubo è sullo scaffale magnetico con il coperchio aperto.

Nota: Faccia non overdry le perle, questa può provocare il recupero più basso di DNA. Quando le perle cominciano fendersi, sono troppo asciutte.

7. Rimuova il tubo dallo scaffale magnetico. Aggiunga l'amplificatore dell'eluizione di 22 μl (Tris-HCl, pH8.0-8.5 di 10mM) al tubo. Mescoli bene pipettando su e giù almeno 10 volte o su un miscelatore di vortice per 30 lo S. incuba per il min 3-5 alla temperatura ambiente.

8. Disponga il tubo sullo scaffale magnetico. Dopo il min 5 (o quando la soluzione è chiara), surnatante del μl di trasferimento 20 ad un nuovo tubo. La selezione è completata ed il DNA selezionato può essere usato per gli esperimenti successivi o essere immagazzinato a lungo a -20°C.

Amplificazione delle biblioteche

1. Prepari la seguente reazione in un tubo di PCR di 200 μl:

2. Vortice delicatamente e rotazione giù brevemente per mescolarsi bene, centrifugare brevemente e raccogliere tutto il liquido al fondo del tubo.

3. Esegua la seguente reazione in un cycler termico:

Soluzione raccomandata per pulizia di PCR/selezione di dimensione (il volume magnetico specifico della perla dovrebbe essere il regolato secondo la dimensione del campione reale)

1. Prepari 50 prodotti di legatura del μl in un tubo centrifugo appropriato.

2. Aggiunga il μl 45 delle perle magnetiche risospese di selezione del DNA al campione. Delicatamente colpo con una pipetta per 10 volte (o vortice per 30 s). Incubi i campioni per il min 5 alla temperatura ambiente.

3. Disponga il tubo su uno scaffale magnetico appropriato per separare le perle dal surnatante. Quando la soluzione è chiara, rimuovere e scartare con attenzione il surnatante con una pipetta (non scarti le perle).

4. Aggiunga un μl 200 dell'etanolo appena preparato di 80% al tubo mentre nello scaffale magnetico. Incubi alla temperatura ambiente per 30 s e poi rimuovere e scartare con attenzione il surnatante (non disturbi le perle).

5. Ripeti una volta punto 4 per complessivamente due lavaggi.

Nota: Sia sicuro di rimuovere tutto il liquido visibile dopo seconda Washington.

6. Asciughi all'aria le perle finché la superficie delle perle magnetiche non abbia lucentezza ovvia mentre il tubo è sullo scaffale magnetico con il coperchio aperto.

Nota: Faccia non overdry le perle, questa può provocare il recupero più basso di DNA. Quando le perle cominciano fendersi, sono troppo asciutte.

7. Rimuova il tubo dallo scaffale magnetico. Aggiunga l'amplificatore dell'eluizione di 22 μl (Tris-HCl, pH8.0-8.5 di 10mM) al tubo. Mescoli bene pipettando su e giù almeno 10 volte o su un miscelatore di vortice per 30 lo S. incuba per il min 3-5 alla temperatura ambiente.

8. Disponga il tubo sullo scaffale magnetico. Dopo il min 5 (o quando la soluzione è chiara), surnatante del μl di trasferimento 20 ad un nuovo tubo. La selezione è completata ed il DNA selezionato può essere immagazzinato a 2-8°C per 1-2 settimane o essere immagazzinato a lungo a -20°C.

[Appendice] schema raccomandato per la selezione su due lati

Se la selezione doppio rotonda è richiesta, forniamo il seguente schema per selezionare il volume magnetico appropriato della perla secondo la dimensione prevista delle biblioteche. La selezione di dimensione può essere realizzata prima della riparazione di conclusione o dopo l'amplificazione. La selezione due o doppio più rotondi notevolmente ridurrà il rendimento delle biblioteche.

Riempia il volume delle biblioteche nella tavola qui sotto a μl 100. Selezioni il volume di perle magnetiche in due giri secondo la dimensione prevista delle biblioteche. Ed effettui l'operazione di selezione secondo le seguenti istruzioni.

Quantità raccomandata della tabella 3 di perle magnetiche per la selezione Doppio rotonda

1. Riempia il volume delle biblioteche a μl 100 in un tubo di PCR 200μl ed identificato come A. Add certo volume di perle magnetiche secondo la tabella 3 (giro 1) al colpo di A. Gently del tubo con una pipetta per 30 S. incuba i campioni per il min 5 alla temperatura ambiente.

2. Disponga il tubo A su uno scaffale magnetico appropriato per separare le perle dal surnatante. Quando la soluzione è chiara, rimuova con attenzione il surnatante ad un nuovo tubo ed identifichilo come perle di B. Discard.

3. Aggiunga certo volume di perle magnetiche secondo la tabella 3 (giro 2) al colpo di B. Gently del tubo con una pipetta per 30 S. incuba i campioni per il min 5 alla temperatura ambiente. Disponga il tubo B sullo scaffale magnetico. Quando la soluzione è chiara, rimuovere e scartare con attenzione il surnatante.

4. Aggiunga un μl 200 dell'etanolo appena preparato di 80% al tubo B mentre nello scaffale magnetico. Incubi alla temperatura ambiente per 30 s e poi rimuovere e scartare con attenzione il surnatante (non disturbi le perle).

5. Ripeti una volta punto 6 per complessivamente due lavaggi.

Nota: Sia sicuro di rimuovere tutto il liquido visibile dopo seconda Washington.

6. Asciughi all'aria le perle finché la superficie delle perle magnetiche non abbia lucentezza ovvia mentre il tubo B è sullo scaffale magnetico con il coperchio aperto.

Nota: Faccia non overdry le perle, questa può provocare il recupero più basso di DNA. Quando le perle cominciano fendersi, sono troppo asciutte.

7. Rimuova il tubo B dallo scaffale magnetico. Aggiunga l'amplificatore dell'eluizione di 22 μl al tubo. Mescoli bene pipettando su e giù almeno 10 volte o su un miscelatore di vortice per 30 lo S. incuba per il min 3-5 alla temperatura ambiente.

Nota: Se il bloccaggio mirato a non sarà eseguito, aggiunga l'amplificatore dell'eluizione (Tris-HCl di 10mM, pH 8.0-8.5) per l'eluizione. Altrimenti, l'acqua ultrapure sterilizzata dovrebbe essere usata per l'eluizione.

• Tubo B del posto sullo scaffale magnetico. Surnatante del μl di trasferimento 20 ad un nuovo tubo.

Per uso di ricerca soltanto