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Primi reagenti di PCR della trascrittasi inversa del corredo R1011/R1012 di sintesi del filo CDNA
Dettagli:
| Luogo di origine: | La Cina |
| Marca: | GDSBio |
| Certificazione: | / |
| Numero di modello: | R1011/R1012 |
Termini di pagamento e spedizione:
| Quantità di ordine minimo: | 1box |
|---|---|
| Imballaggi particolari: | il piccolo pacchetto o la massa distribuisce o OEM |
| Tempi di consegna: | giorni 8work |
| Termini di pagamento: | L/C, D/A, D/P, T/T, Western Union, MoneyGram |
| Capacità di alimentazione: | 100 scatola/scatole al giorno |
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Informazioni dettagliate |
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| Gatto. No.: | R1011/R1012 | Concentrazione: | R1011 (20 rxns), R1012 (100 rxns) |
|---|---|---|---|
| Aspetto: | incolore | Gruppo: | Reagenti di PCR della trascrittasi inversa |
| Attività: | Passaggio | Capacità di amplificazione: | / |
| Logo Printing: | Con Logo Printing | Pacchetto di trasporto: | Imballaggio |
| Capacità di produzione: | 100 scatola/scatole al giorno | Condizioni di stoccaggio: | Deposito a -20°C |
| Evidenziare: | 20 reagenti di PCR della trascrittasi inversa dei rxns,100 reagenti di PCR della trascrittasi inversa dei rxns,primo corredo di sintesi di cdna del filo di 20 rxns |
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Descrizione di prodotto
RT - corredo di PCR
Per uso di ricerca soltanto
Cat No. R1011, 20 rxns
Cat No. R1012, 100 rxns
Componenti del corredo
| Componente | R1011 (20 rxns) | R1012 (100 rxns) |
| M-MLV (200U/μl) | μl 20 | μl 100 |
| RNasin (40U/μl) | μl 12 | μl 60 |
| (Distacco) 15 oligo (50μM) | μl 20 | μl 100 |
| Iniettore casuale di esamero (50μM) | μl 20 | μl 100 |
| amplificatore del Primo filo 5× | μl 80 | μl 400 |
| ddH senza RNAsi2 O | 1 ml | 1 ml di × 5 |
| dNTPs (10mM ciascuno) | μl 50 | μl 250 |
Stoccaggio
Tutte le componenti del corredo dovrebbero essere immagazzinate a -20°C. tengono il RNA di controllo a -70°C per immagazzinaggio più di lunga durata.
Descrizione
Il corredo di RT-PCR è ottimizzato per sintetizzare il cDNA del primo filo da poli purificato (A) + o da RNA totale. Il corredo di RT-PCR per RT-PCR consegna i rendimenti aumentati del cDNA, l'alta sensibilità e le trascrizioni integrali in un formato conveniente. Ottenete tutte componenti che avete bisogno di per la riuscita sintesi del cDNA del primo filo, salvando il vostro tempo ed assicurando il vostro successo con ogni esperimento. La trascrittasi inversa del corredo è una versione di M-MLV RT che è stato costruito per ridurre l'attività della RNAsi H e per fornire la stabilità termica aumentata. L'enzima è usato per sintetizzare il cDNA ad una gamma di temperature di 42-55°C, fornente la specificità aumentata, i più grandi rendimenti di cDNA ed il prodotto più integrale che altre trascrittasi inverse.
Applicazioni
Prima sintesi del cDNA del filo per RT-PCR
Costruzione delle biblioteche del cDNA
RT-PCR una tappa
Estensione dell'iniettore
Note importanti
Prevenzione della contaminazione della ribonucleasi
La purezza e l'integrità del RNA è essenziali per la sintesi di cDNA integrale. Il RNA può essere degradato da RNAsi A, che è un agente inquinante altamente stabile trovato in tutto l'ambiente del laboratorio. Tutte le componenti del corredo rigorosamente sono state provate per assicurare che fossero senza RNAsi. Per impedire la contaminazione sia l'ambiente che i reagenti del laboratorio, tutte le soluzioni pronte devono essere esenti dai rnasi. Raccomandazioni generali evitare contaminazione della RNAsi:
- DEPC-ossequio tutti i tubi e punte della pipetta da utilizzare nella sintesi del cDNA o per usare labware senza nucleasi certificato.
- Indossi i guanti quando trattano il RNA e tutti i reagenti, poichè la pelle è una fonte comune di rnasi. Guanti del cambiamento frequentemente.
- Usi i reagenti senza RNAsi, compreso l'acqua di alta qualità (per esempio, acqua DEPC-trattata).
- Usi un inibitore della RNAsi, quale Dongsheng RNasin (#R2011) per proteggere il RNA dall'attività dei rnasi.
- Tenga tutte le componenti del corredo sigillate strettamente una volta non in uso. Tenga tutti i tubi strettamente si è chiuso durante la reazione inversa della trascrizione.
RNA del modello
Il RNA cellulare totale isolato con i metodi standard è adatto ad uso con il corredo. Il RNA purificato deve essere esente dai sali, dagli ioni del metallo, dall'etanolo e dal fenolo da evitare inibire la reazione della sintesi del cDNA. I contaminanti della traccia possono essere rimossi dalla precipitazione dell'etanolo del RNA seguito da due lavaggi della pallina con l'etanolo freddo di 75%. Per le applicazioni di RT-PCR, il RNA del modello deve essere esente da contaminazione del DNA. Prima della sintesi del cDNA, il RNA può essere trattato con la dnasi I per eliminare le tracce di DNA. Dnasi devo essere ottenuto dall'utente. Esegua sempre una reazione di controllo (RT-meno) che comprende tutte le componenti per RT-PCR eccezione fatta per l'enzima della trascrittasi inversa.
Digestione della RNAsi H
La sensibilità del punto di PCR può essere aumentata (particolarmente per i modelli lunghi) rimuovendo il modello del RNA dal cDNA: Molecola ibrida del RNA tramite digestione con RNAsi H dopo la sintesi del primo filo. La presenza di RNAsi H durante la sintesi del primo filo degraderà il modello mRNA, con conseguente sintesi integrale in diminuzione del cDNA e rendimenti in diminuzione del cDNA del primo filo.
Iniettori
La sintesi del primo cDNA del filo può essere innescata con (distacco) l'iniettore oligo 15, gli iniettori casuali o gli iniettori gene-specifici.
(Distacco) 15 oligo innescano la sintesi del cDNA dal poli presente della coda (A) al 3' - estremità del mRNA eucariotico. Gli iniettori casuali iniziano la sintesi del cDNA dalla popolazione totale del RNA (rRNA e mRNA). Di conseguenza, facendo uso degli iniettori casuali per i primi risultati di sintesi del filo in una maggior complessità del cDNA generato rispetto (distacco) all'iniettore oligo 15. Di conseguenza, la sensibilità e la specificità delle reazioni successive di PCR possono essere ridotte. Tuttavia, c'è parecchie applicazioni dove è utile utilizzare gli iniettori casuali, quale la sintesi del cDNA facendo uso dei mRNAs senza una poli coda (A), o la sintesi del cDNA facendo uso di poli (A) - campioni arricchiti del RNA.
gli iniettori Gene-specifici sono utilizzati per sintetizzare il cDNA specifico da uno stagno di RNA o del mRNA totale e devono essere ottenuti dall'utente.
Procedura di sintesi prima del cDNA del filo
La reazione prima del cDNA del filo può essere eseguita come singola reazione o come serie di reazioni parallele con differenti modelli del RNA. Di conseguenza, la miscela di reazione può essere preparata combinando i reagenti individualmente o una miscela matrice che contiene tutte componenti eccetto il RNA del modello può essere preparata. Secondo la struttura del modello del RNA, i punti separati per denaturazione del RNA e la ricottura dell'iniettore possono migliorare i risultati di RT-PCR.
Protocollo
I. Prima sintesi del cDNA del filo
1. Aggiunga i seguenti reagenti in un tubo sterile e senza nucleasi su ghiaccio nell'ordine indicato:
| RNA del modello |
poli (A) mRNA o RNA specifico |
1-5 μg |
| Iniettore |
(distacco) iniettore oligo 15 o iniettore casuale di esamero |
1 μl 1 μl |
| acqua DEPC-trattata | a μl 12,4 | |
| Volume totale | μl 12,4 | |
2. Mescoli delicatamente, centrifughi brevemente ed incubi a 70°C per 5 min. di freddo su ghiaccio, filare giù e disporre la fiala indietro su ghiaccio.
3. Prepari la seguente miscela della sintesi del cDNA, aggiunga le seguenti componenti nell'ordine indicato:
| amplificatore del primo filo 5× | μl 4 |
| dNTPs (10 millimetri ciascuno) | 1 μl |
| RNasin | 0,6 μl |
| M-MLV | 1 μl |
4. Mescoli delicatamente e centrifughi brevemente.
5. Per (distacco) 15 oligo, incubi per il min 60 a 42°C. Per l'esamero casuale la sintesi innescata, incuba per il min 60 a 37°C.
6. Termini la reazione riscaldando a 70°C per 5 min.
Il prodotto inverso della reazione della trascrizione può essere utilizzato immediatamente nelle seconde reazioni della sintesi del cDNA del filo o essere immagazzinato a -20°C per di meno che una settimana. Per immagazzinaggio più di lunga durata, -70°C è raccomandato.
II. amplificazione di PCR del primo cDNA del filo
Il prodotto della prima sintesi del cDNA del filo può essere utilizzato direttamente nella PCR o nel qPCR. Il volume di prima miscela di reazione della sintesi del cDNA del filo non dovrebbe comprendere più di 1/10 del volume totale della reazione di PCR. Normalmente, il μl 2 della prima miscela di reazione della sintesi del cDNA del filo è utilizzato come modello per la PCR successiva in un volume totale di 50 μl.
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