Reagenti R3001 2000U di PCR della trascrittasi inversa dell'oro

Trascrittasi inversa R3001 (2,000U) dell'oro

Trascrittasi inversa dell'oro

Per uso di ricerca soltanto

Componenti

Stoccaggio

Questo reagente dovrebbe essere tenuto a -30~15°C.

Descrizione

La trascrittasi inversa dell'oro è una nuova trascrittasi inversa ottenuta da evoluzione molecolare in vitro basata sulla trascrittasi inversa di M-MLV (RNAsi h). Il primo filo di cDNA può essere sintetizzato alla trascrittasi inversa dell'oro 37~55°C. ha ulteriore sensibilità significativamente migliore, la specificità, la stabilità termica e emivita, che è molto adatta a trascrizione inversa dei modelli del RNA con la struttura secondaria complessa. La trascrittasi inversa dell'oro ha più forte abilità di estensione e di polimerizzazione, che può essere usata per la sintesi di cDNA lungo e la costruzione della proporzione elevata della biblioteca integrale del cDNA.

Definizione dell'unità

Poli (Ra)·Oligo (distacco) è stato usato come il modello/iniettore. A 37°C per il min 10, la quantità di enzima richiesta per aggiungere 1 dTTP di nmol come sostanza insolubile in acido è stata definita come 1 unità di attività (u).

Controllo di qualità

Rilevazione del residuo di Exonuclease: Il substrato del DNA unico incagliato pmol 200 U di questo prodotto e 50 è stato incubato a 37°C per 16 h e la banda dell'elettroforesi del DNA non è cambiato dopo l'elettroforesi della PAGINA di denaturazione.

Rilevazione del residuo dell'endonucleasi: 200 U di questo prodotto e di 0,3 μg di DNA pBR322 sono stati incubati a 37°C per 4 h e le bande dell'elettroforesi dei plasmidi non sono state cambiate tramite l'elettroforesi del gel di agarosio.

Rilevazione del residuo della RNAsi: il prodotto di 200 U e 1 μg di un RNA di 293 cellule sono stati incubati a 37°C per il min 30 e la banda dell'elettroforesi di RNA era immutata tramite l'elettroforesi del gel di agarosio.

Rilevazione del residuo del DNA di E.coli: il residuo acido nucleico in 60 U è stato individuato dal qPCR gDNA-specifico di Escherichia coli TaqMan ed il residuo di genoma di Escherichia coli era di meno di 10 copie.

Rilevazione funzionale 1: un enzima di 200 U si è aggiunto al sistema inverso della trascrizione, 1 RNA totale delle cellule HeLa del μg è stato usato come modello, (distacco) ₂₃ oligo come iniettore e la reazione è stata condotta a 50°C per il prodotto del cDNA 45 min.1/10 è stata presa per l'amplificazione di PCR del gene di VIN. L'elettroforesi del gel di agarosio con la macchiatura di eb ha mostrato una singola banda di KB 4,6.

Rilevazione funzionale 2: un enzima di 200 U si è aggiunto al sistema inverso della trascrizione, 1 RNA totale delle cellule HeLa della pagina è stato usato come modello, (distacco) ₂₃ oligo come iniettore e la reazione è stata condotta a 50°C per il prodotto del cDNA 30 min.1/10 è stata presa per l'amplificazione di PCR del gene di GAPDH. L'elettroforesi del gel di agarosio con la macchiatura di eb ha mostrato una singola banda di 550 punti di ebollizione.

Rilevazione funzionale 3: le cellule HeLa di 500 NG ammontano al RNA come modello, (distacco) ₂₃ oligo il VN come iniettore, la reazione 50°C per il prodotto del cDNA 45 min.1/10 sono state prese per l'amplificazione di PCR del gene di Polε. L'elettroforesi del gel di agarosio, eb che macchia, singola di una banda (ricca di gascromatografia) di KB 7,1 può essere veduta.

Argomenti che hanno bisogno dell'attenzione

Impedisca la contaminazione della RNAsi

Prego tenga l'area sperimentale pulita. I guanti e le maschere puliti dovrebbero essere indossati durante il funzionamento. senza RNAsi sarà assicurato per i tubi centrifughi, pipettando le punte ed altri materiali di consumo utilizzati nell'esperimento.

Selezione degli iniettori

Continui l'esperimento è PCR

Se il modello è dell'origine eucariotica, il distacco oligo è preferito generalmente, accoppiato con il 3' poli una coda del mRNA eucariotico per rendimento massimo di cDNA integrale.

Gli iniettori specifici del gene (sistema di preferenze generalizzate) hanno il più alta specificità. Tuttavia, in alcuni casi, il sistema di preferenze generalizzate ha usato per la reazione di PCR non può efficacemente guidare la sintesi del primo filo di cDNA. a questo punto, la trascrizione inversa può essere rifatta facendo uso del distacco oligo o degli esameri casuali.

Gli esameri casuali hanno la specificità più bassa e tutto il RNA, compreso il mRNA, rRNA e il tRNA, potrebbe essere usato come modelli per gli esameri casuali. Gli esameri casuali possono essere usati come iniettore quando la regione dell'obiettivo ha una struttura secondaria complessa o un contenuto elevato di GASCROMATOGRAFIA, o quando il modello è prokaryotic e l'uso del distacco oligo o degli iniettori gene-specifici (sistema di preferenze generalizzate) non può efficacemente guidare la sintesi del cDNA.

Continui l'esperimento è qPCR

Il distacco oligo si è mescolato con gli esameri casuali ha provocato la stessa efficienza della sintesi del cDNA in ogni regione del mRNA, contribuendo a migliorare l'autenticità e la ripetibilità dei risultati quantitativi.

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